#单细胞测序#近几年，科学家爱上了单细胞测序技术，采用单细胞测序技术对肿瘤、生殖和罕见病等领域进行了诸多的研究，本文就上海科技大学范教授发表的一篇论文——该技术在组织单个细胞水平和免疫细胞分布的研究进行阐述，以抛砖引玉。
基础信息
发表期刊:Oncogene
影响因子：7.
PMID：
DOI:10./s---0
Author:HeD,WangD,LuP,YangN,XueZ,ZhuX,ZhangP,FanG,
作者单位：ShanghaiInstituteforAdvancedImmunochemicalStudies,ShanghaiTechUniversity
发表日期:年1月
01研究背景
肺腺癌（lungadenocarcinoma）是肺癌的一种，属于非小细胞癌。不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部X线检查时被发现。表现为圆形或椭圆形肿块，一般生长较慢，但有时早期即发生血行转移。淋巴转移则发生较晚。
携带EGFR突变的肺腺癌(LUAD)在亚洲人群中普遍存在。然而，患者间和肿瘤内的异质性还没有在单细胞水平上得到解决。这是作者研究这个问题的原因。
研究人员对来自7个携带EGFR突变的I/II期LUAD样本和5个癌旁肺组织的总共,个细胞进行了单细胞RNA测序。
在肿瘤微环境(TME)中鉴定了不同的细胞类型，其中髓系细胞和T细胞是肿瘤和邻近肺组织中最丰富的基质细胞类型。在肿瘤内，伴随着CD1C+树突状细胞的增加，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)显示出促肿瘤功能，但没有明确的M1或M2极化的特征基因表达。肿瘤浸润性T细胞主要表现为耗竭和调节性T细胞特征。
根据腺癌细胞在缺氧、糖酵解、细胞代谢、翻译起始、细胞周期和抗原提呈等不同途径的基因表达特征，可以将其分为不同的亚型。通过进行拟拟时间轨迹分析，研究人员发现ELF3是在分化末期肿瘤细胞中表达最高的基因之一。肿瘤细胞分泌炎性细胞因子(如IL-1B)后，ELF3表达上调，从而激活PI3K/AKT/NF-κB通路，促进增殖和抗凋亡基因如BCL2L1和CCND1等mRNA的表达。
这篇文章研究揭示了早期LUAD肿瘤微环境中存在EGFR突变的显著异质性，暗示了TME中肿瘤细胞、间质细胞和免疫浸润之间的复杂相互作用。
02方法和性质
使用了术后切除肿瘤组织和癌旁非恶性肺组织。作者对7个携带EGFR基因突变的Ⅰ/Ⅱ期的LUAD样本和5个癌旁组织的总共个细胞进行了单细胞测序。
03数据和结论
图1
作者对所有7个肿瘤样本和5个匹配的肺组织的单个细胞进行了聚类，并检索到32个不同的cluster以及差异表达基因，ScRNA-seq数据显示髓系细胞和T淋巴细胞占基质细胞的大多数。
免疫成分对肿瘤的发生发展有重要影响，作者先研究了免疫浸润在早期LUAD样本中的特征。
髓样细胞在LUAD和正常肺中占有最丰富的免疫浸润，作者将髓样细胞分成了14个不同的亚群。
图2
作者发现大部分细胞是表达CD68的巨噬细胞。与正常癌旁组织相比，其树突状细胞增多，而癌旁组织减少。与正常巨噬细胞相比，TAMs（肿瘤相关巨噬细胞）高表达APOE和SSP1，这两种蛋白可以促进肿瘤生长和侵袭。富含TAMS的DEGS与细胞外基质分解、对缺氧的反应、胆固醇外流的正调节以及对TNF和IL1B的反应(图2D)有关，意味着它们可能促进细胞迁移、血管生成、肿瘤进展和炎症。作者鉴定了一个高表达的细胞周期相关基因的TAM基因集（图2b中的集群8）例如NUPR1、STMN1、MKI67这几个基因。
作者通过IHC使用抗CD68和Ki67抗体证实了这些增殖性巨噬细胞在肿瘤组织中存在。
前人研究表明，肿瘤中的TAMs的表型类似于抗炎的M2极化巨噬细胞。作者研究了传统的经典激活巨噬细胞(M1)和替代激活巨噬细胞(M2)特征基因在这些cluster中的表达(图2F）。而肿瘤和正常肺组织中的巨噬细胞都没有表现出特异性的M1或M2特征。相反，它们具有相似的M1和M2特征基因的表达水平(图2G)。
综上，虽然早期LUAD中的TAM似乎表达促进肿瘤发生的基因，但它们还没有明显的M1和M2极化。
图3
接下来，作者对T细胞进行聚类，所有T细胞的无偏聚类在肿瘤样本和正常组织之间没有显示任何不同的T细胞cluster，然后作者决定检查每个cluster中T细胞亚型标志物的表达情况。发现肿瘤浸润的T细胞高表达调节和耗竭标记，如TIGIT，LAYN，FOXP3和CTLA4。发现了一种增殖T细胞亚型(第7cluster，Ki67高表达)，它既显示了效应性T细胞特征(例如，GZMA)，又显示了功能抑制的标志物，如LAG3、TIGIT和PD-1，表明CTL细胞*活性受到抑制(图3D)。
树突状细胞在介导T细胞趋化、分化和活化过程中起着至关重要的作用。在数据集中，LUAD中的DC主要是CD1C+，这意味着它们具有抑制效应性T细胞和促进调节性T细胞的功能(图3D，e)。
综上所述，结果提示，早期LUAD具有免疫抑制作用，T细胞分化为调节性和耗竭性T细胞亚型，并伴有CD1C+DC的增多。
图4
为了进一步验证肿瘤组织中恶性和非恶性细胞，以癌旁组织中肺上皮细胞为背景对照，从15,个基因的表达强度中推断出跨越潜在恶性细胞每条染色体的大规模拷贝数变异(CNV)。CNV异常的细胞被鉴定为恶性细胞(图4A)，根据对功能富集分析，进一步将其分为8个cluster(图4B)。这些cluster分别富含缺氧、糖酵解、氧化磷酸化、翻译起始、细胞周期和抗原递呈等途径(图4C）。作者发现Clara细胞前体标志物SCGB3A2和肺泡上皮祖细胞标志物TM4SF1在肿瘤细胞中表达上调(图4D，e)。由于肿瘤细胞同时高表达近端和远端上皮祖细胞标志物，肿瘤细胞由具有不同细胞系表达谱的异质群体组成。
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确定了在拟时间轨迹内在更高级的细胞中上调的基因。在这项研究中，作者将重点放在ELF3的作用上，ELF3是一种调节肺上皮细胞发育的转录因子，它与气道炎症有关，并在前列腺癌和结直肠癌中介导炎症信号和肿瘤进展。
图5c图5d
使用了TCGALUAD数据(n=)，与正常肺组织相比，ELF3在肿瘤样本中上调(图5C)。此外，GSEA显示，CCND1和AKT上调的基因集在ELF3表达水平较高的肿瘤(图5D)。
综上所述，这些结果提示ELF3在更晚期的LUAD细胞中表达上调，并与LUAD中CCND1和AKT的表达上调有关。IL1B诱导后ELF3通过PI3K/Akt/NFκB信号通路促进肿瘤生长。
图6
推测ELF3可能是LUAD中NF-κB通路的重要调节因子。作者首先证实了，与正常肺组织相比，肿瘤组织中ELF3的蛋白水平上调(图6A)。然后，用实时定量聚合酶链反应检测了ELF3和NF-κB靶基因在另外12例LUAD组织中的表达。
发现ELF3在所有肿瘤组织中的表达均高于匹配的正常组织。一些NF-κB靶基因，如CCND1、BCL2L1、GADD45B和ICAM1对于增殖，抗凋亡和黏附也在肿瘤组织中上调(图6B)。用siRNAs敲除ELF3后，NFKB1的表达保持不变(图6C)。一些NF-κB靶基因BCL2L1、CCND1和Ptgs2在两种细胞系中下调，而其他负责血管生成(即VEGFA)和转移(即MMP9)的基因保持不变(图6C)。
基因表达的降低至少部分是由于PI3K/AKT/NF-κB通路的失活，因为PI3K、AKT、IKA和p65的磷酸化蛋白在ELF3基因敲除后都减少了(图6d)。为了确定ELF3是否参与了LUAD细胞中NF-κB通路的激活，首先用IL1B处理A和NCI-H细胞。作者发现ELF3和与细胞生存和炎症相关的NF-κB靶基因，如BCL2L1，CCND1，PTGS2和ICAM1(图6E)的表达增加，当ELF3在两种细胞系中被击倒时(图6F)，这一表达受到影响。
综上所述，肿瘤微环境中的促炎细胞因子IL1B可上调LUAD肿瘤细胞中ELF3的表达，从而增强NF-κB通路的激活，从而有利于肿瘤细胞的存活和生长。这些结果提示，LUAD肿瘤细胞中的ELF3可能成为阻止肿瘤生长的一个新的治疗靶点。
04讨论
以前很少有研究将肺肿瘤细胞的转录组和它们的TME一起研究，无论是成批的还是在单细胞水平上的，作者全面地分析了肿瘤标本中不同的细胞亚群。鉴定了不同的肿瘤细胞亚群及其TME成分，表明LUAD在肿瘤发生的早期就已经出现了异质性。
我们发现在LUAD早期样本及其邻近对照组织中，髓样细胞和T细胞是最丰富的基质细胞类型。在单细胞分辨率下，发现了肺内停留的巨噬细胞是最丰富的基质细胞群，表现出CD68的高表达，但不表达CD11b。结果表明，免疫TME对肿瘤有促进作用，而对免疫有抑制作用。事实上，TAMs显示高水平的基因表达丰富在促进细胞迁移、血管生成、肿瘤进展和炎症的途径中(例如，APOE和SPP1)(图2)。最后，LUAD中TAMS的免疫抑制状态不能简单地用M2极化来解释，即TAMS没有极化到M1或M2的不同状态。
有趣的是，在TAMS和T细胞中都发现了增殖细胞亚型，其特征是高表达细胞增殖标记物MKI67。它们在LUAD中几乎没有报道，但在其他类型的肿瘤中，增殖的TAMS和T细胞也被研究过。在T细胞中，作者鉴定出一种同时表达效应性T细胞标记和功能障碍标记的增殖亚型(图3C)。还在LUAD患者的TME中发现了更多的调节性和耗竭的T细胞cluster，与CD1C+DC数量的增加相关。
探索了一个重要的调节因子ELF3在LUAD中介导TAMS与肿瘤细胞相互作用中的机制。证明一些TAM高表达炎性细胞因子基因，如IL1B(图2F)，它通过激活NF-κB途径在肿瘤生长和抗凋亡过程中发挥作用。我们推测，TAMs可能通过释放的IL1B可在LUAD肿瘤细胞中上调ELF3表达。体外细胞实验发现，下调ELF3的表达可减弱两株LUAD细胞株A(KRAS突变)和NCI-H(κ突变LR)中NF-EGFRB通路基因的激活，这一发现表明炎性细胞因子(如IL1B)通过ELF3作用调节肿瘤细胞增殖和抗凋亡。
05研究展望
这项工作为了解亚洲患者中携带EGFR突变的早期LUAD患者的异质性和免疫细胞图谱提供了有价值的资源。发现了包括ELF3在内的介导肿瘤细胞与其TME成分相互作用的关键基因，提示ELF3可能成为LUAD未来抗肿瘤新药的治疗靶点。
